23 März 2015

Kostengünstige Bio-Kaskade für Caprolactam-Synthese

Chemiker der Uni Graz entwickeln kostengünstigeres und umweltfreundlicheres Verfahren zur Herstellung des wichtigen Grundmonomers

ε-Caprolactam kommt als Monomer für die Herstellung von Nylon-6 bzw. Polyamid-6 zum Einsatz und findet breiteste Anwendung u.a. in der Textilindustrie oder bei der Herstellung technischer Formteile. Chemiker der Uni Graz haben nun ein neues, kostengünstigeres und umweltfreundlicheres Verfahren zur Herstellung des wichtigen Grundbausteins entwickelt.

Die Produktion des Nylon-6 Monomers ε-Caprolactam stellt mit 4,2 Millionen Tonnen pro Jahr einen der größten und bedeutendsten industriellen Prozesse dar [1 – 3]. Die Herstellung dieser Grundsubstanz zahlreicher Nylon-basierter Produkte erfolgt über die Umsetzung von Cyclohexanon mit Hydroxylamin zum entsprechenden Oxim und anschließender Beckmann-Umlagerung (s. Abb. 1). Für die Bereitstellung von Hydroxylamin wird Ammoniak und Wasserstoffperoxid benötigt. Die Umlagerungsreaktion läuft in Gegenwart starker Säuren ab, was zu einer signifikanten Menge an Salzen durch die nachfolgende notwendige Neutralisation des Reaktionsgemisches führt.

In einer kürzlich publizierten Studie [4] wurde ein Konzept für eine künstliche enzymkatalysierte Kaskade entworfen, die, ausgehend von Cyclohexanol, die Darstellung der hydrolysierten ε-Caprolactam-Verbindung 6-Aminohexansäure erlaubt. Letztere kann durch Wärmebehandlung in ε-Caprolactam umgewandelt werden.

Diese Kaskade wurde in zwei Module, die in sich redox-neutral sind, unterteilt: Modul 1 kombiniert die Oxidation des Cyclohexanols mit einer Baeyer-Villiger Monooxygenase, welche unter Verbrauch von Sauerstoff ε-Caprolacton produziert (s. Abb. 2) [5]. Die NADPH-Cofactor-Abhängigkeit dieses Moduls wird durch die strikte Affinität der Bayer-Villiger Monooxygenase (BVMO) bezüglich des Cofaktors NADPH bestimmt. Das in der Oxidationsreaktion des Cyclohexanols zu Cyclohexanon gewonnene Hydrid in Form von NADPH wird in diesem Modul in der enzymatischen Baeyer-Villiger Reaktion wieder verbraucht, wodurch das notwendige NADP+ für die erste Stufe wieder generiert wird.

ε-Caprolacton wird in Modul 2.0 durch eine Hydrolase (Lactonase) geöffnet, sodass eine ω-Hydroxysäure gebildet wird. Oxidation der primären Alkoholfunktion mittels einer Alkoholdehydrogenase (prim-ADH) und reduktive Aminierung des entstehenden Aldehydes mit einer Transaminase (ω-TA) führen unter Umwandlung des Aminodonors L-Alanine zu Pyruvat und zur Bildung des gewünschten Produktes 6-Aminohexansäure. Das Nebenprodukt Pyruvat wird unter Verbrauch von Ammoniak durch eine Alanin-Dehydrogenase (AlaDH) zu L-Alanine rezykliert, wobei auch hier wiederum das in der Oxidationsreaktion des primären Alkohols zum Aldehyd gewonnene Hydrid (NADH) direkt in der reduktiven Aminierung des Pyruvats zum Alanin verwendet wird, was eine Rezyklierung des Aminodonors innerhalb der enzymatischen Kaskadenreaktion darstellt. Dieses Rezyklisierungsystem arbeitet unter Einsatz von NAD+-abhängigen Enzymen, um so die Kompatibilität des Cofaktor-Systems zu Modul 1 zu gewährleisten, welcher NADP(H) abhängig ist.

Diese Kaskade sollte die Synthese der 6-Aminohexansäure alleine unter Verbrauch von Sauerstoff und Ammoniak als stöchiometrische Reagenzien ermöglichen.

Während Modul 1 für sich alleine mit 96 % Umsatz von Cyclohexanol zu ε-Caprolacton extrem effizient arbeitete, erwies sich die durch die Hydrolase gebildete ω-Hydroxysäure innerhalb des Moduls 2.0 im Laufe der Untersuchungen als inhibierendes Intermediat.

Weiterentwicklung des Moduls 2.0 zur Caprolactam-Produktion

Modul 2.0 konnte die durch die Hydrolase gebildete 6-Hydroxyhexansäure nur ungenügend weiter umsetzen. Tests für ähnliche Umsetzungen mit analogen Substraten wie 1-Hexanol oder auch 6-Hydroxyhexansäureethylester bzw. des entsprechenden Methylesters anstatt der 6-Hydroxyhexansäure führten sehr wohl zu den entsprechenden primären Aminen mit vollständigem Umsatz.

Somit musste eine Strategie entwickelt werden, welche die Inhibierung durch die Säurefunktion von 6-Hydroxyhexansäure verhindert.

Der Einsatz alternativer primärer Alkoholdehydrogenasen, die in der Literatur als „Spezialisten“ bezüglich dem Substrat 6-Hydroxyhexansäure bekannt sind (zwei ADHs aus Acinetobacter sp. bzw. Brevibacterium epidermitis), scheiterte an deren geringen Stabilität und der schwierigen heterologen Expression in E.coli als Wirtsorganismus.

Als Lösung dieses Problems wurde im Rahmen der hier beschriebenen Arbeit die Ringöffnung des Lactons mit Methanol oder Ethanol als Nukleophil anstelle von Wasser in der wässrigen Pufferlösung erwogen. Dies führt zur Bildung des Esters anstatt der Säure, daher würde die Säurefunktion maskiert und die Inhibierung könnte umgangen werden. Ein Enzym, das eine solche Reaktion im wässrigen Medium erlaubt, war jedoch in der Literatur nicht bekannt. Methanol bekam gegenüber Ethanol den Vorzug, weil Ethanol für die primäre Alkoholdehydrogenase selbst ein gutes Substrat darstellen würde und dies zu unerwünschten Nebenprodukten beziehungsweise Problemen im internen Cofactor-Rezyklierungssystem des Moduls 2.0 führen könnte.

Ein Screening innerhalb der Hydrolasen-Familie nach Lactonasen und Lipasen mit der gewünschten Selektivität blieb jedoch erfolglos. Innerhalb der Familie der Esterasen (18 getestete Esterasen) konnten jedoch vier Enzyme identifiziert werden, die die gewünschte Reaktion (teilweise) durchführten. Im Detail waren dies eine Esterase aus Bacillus subtilis (deren Kristallstruktur bereits bekannt ist, siehe pdb 2R11), zwei Esterasen aus der Schweineleber (die Isoenzyme PLE03 und PLE06) sowie eine kommerzielle Roh-Pferdeleberpräparation. Da die Schweineleberesterasen mit den Pferdeleberesterasen strukturell verwandt sind, kann davon ausgegangen werden, dass tatsächlich die Esterasen die Reaktion katalysieren und nicht ein anderes Enzym innerhalb der Pferdeleber-Präparation.

Bis zu 75% Umsatz mit Pferdeleberesterase

Das so zu Modul 2.1 (s. Abb. 3) umfunktionierte ursprüngliche Modul 2.0 (vergleiche Abb. 2) liefert in Anwesenheit von 10% Methanol (v/v) das gewünschte Produkt 6-Aminohexansäure mit 47% Umsatz, wenn die Esterase aus Bacillus subtilis für die Ringöffnung zum Einsatz kam. Im Falle der Schweineleberesterase PLE03 wurden 29% Umsatz erhalten. Das beste Resultat konnte mit der Pferdeleberesterase-Präparation erhalten werden. Hier wurden 75% des Lactons innerhalb des verbesserten Moduls 2.1 zu 6-Aminohexansäure umgesetzt.

Eine Kombination aus Modul 1 und Modul 2.1 blieb zunächst ineffektiv, weil die Baeyer-Villiger Monooxygenase nur eine geringe Stabilität in Gegenwart von Methanol als Co-Lösungsmittel besitzt. Eine Reduktion von 10% auf 2% Methanol führte zu einem Umsatz von 30% zur 6-Aminohexansäure.

Durch Zugabe von Methanol zum Reaktionspuffer und dem Einsatz von Pferdeleberesterase konnte die Säurefunktion im Rahmen der Ringöffnung des Lactons maskiert werden, wodurch diese Inhibierung und eine daraus resultierende Akkumulierung dieses Intermediates verringert wurde.

 

Literatur

[1] HH. A. Wittcoff, B. G. Reuben, J. S. Plotkin, in Ind. Org. Chem., John Wiley & Sons, Inc., 2012, pp. 349–354.

[2] J. Ritz, H. Fuchs, H. Kieczka, W. C. Moran, in Ullmann’s Encycl. Ind. Chem., Wiley-VCH, Weinheim, 2011, DOI: 10.1002/14356007.a05_031.pub2.

[3] JG. Bellussi, C. Perego, CATTECH 2000, 4, 4–16.

[4] J. H. Sattler, M. Fuchs, F. G. Mutti, B. Grischek, P. Engel, J. Pfeffer, J. M. Woodley, W. Kroutil, Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 14153-14157. DOI: 10.1002/anie.201409227. http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.201409227/abstract

5] H. Mallin, H. Wulf, U. T. Bornscheuer, Enzyme Microb. Technol. 2013, 53, 283–287.

[6] S. Staudt, U. T. Bornscheuer, U. Menyes, W. Hummel, H. Gröger, Enzyme Microb. Technol. 2013, 53, 288–292.
* Dr. J. H. Sattler, Prof. Dr. W. Kroutil : Universität Graz, Institut für Chemie, Organische/Bioorgansiche Chemie, 8010 Graz

Source: LaborPraxis Vogel, 2015-03-18.

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